Wpływ eksperymentalnej terapii z użyciem kurkuminy, kapsaicyny i resweratrolu na zmiany behawioralne, poziom GAG oraz obwodowe i ośrodkowe procesy zapalne w mysim modelu mukopolisacharydozy IIIB

Raport

Zarys teoretyczny projektu

Mukopolisacharydozy (MPS) należą do grupy lizosomalnych chorób spichrzeniowych [Ballabio i Gieselmann, 2009], spowodowanych brakiem bądź niską aktywnością enzymów przeprowadzających reakcje degradacji glikozoaminoglikanów (GAG) [Muenzer, 2011]. GAG są to nierozgałęzione łańcuchy wielocukrowe, odgrywające ważne funkcje w zachowaniu elastyczności tkanki łącznej oraz ułatwianiu wiązania się różnych czynników wzrostowych do ich receptorów na powierzchni komórek [Platt i wsp., 2012]. W zdrowym organizmie degradacja GAG odbywa się w lizosomach dzięki aktywności kilkunastu enzymów, które sekwencyjnie usuwają poszczególne cukry proste lub grupy chemiczne z łańcuchów GAG. Sekwencyjny sposób degradacji powoduje, że defekt jednego z enzymów uniemożliwia działanie wszystkim następnym [Muenzer, 2011]. W związku z tym, degradacja GAG zatrzymuje się na określonym etapie, a niezdegradowane cząsteczki gromadzą się w lizosomach.

Jedną z obecnie stosowanych terapii MPS jest enzymatyczna terapia zastępcza polegająca na dostarczeniu do organizmu pacjenta brakującego enzymu [Arfi i wsp., 2012]. Terapia ta daje bardzo dobre efekty w przypadku każdego z typów MPS, z wyjątkiem tych typów, które dotykają ośrodkowy układ nerwowy (głównie MPS III), gdyż podawany enzym nie przekracza bariery krew-mózg [Banecka-Majkutewicz i wsp., 2012]. Pacjenci cierpiący na neuronopatyczne typy MPS pozostają więc bez terapii do dnia dzisiejszego.

Ostatnie miesiące badań skłaniają aby zwrócić uwagę na proces autofagii jako alternatywną strategię terapeutyczną dla MPS III. Autofagia jest silnie konserwowanym procesem zachodzącym we wszystkich komórkach eukariotycznych na niskim poziomie i aktywowanym w zwiększonym stopniu poprzez działanie różnych czynników zewnętrznych lub poprzez pojawienie się nieprawidłowo zwiniętych makrocząsteczek. Makrocząsteczka taka otoczona zostaje błoną izolującą, która następnie zamyka się w pęcherzyk nazywany autofagosomem. Pęcherzyk ten ulega następnie fuzji z lizosomem, a enzymy lizosomalne trawią jego wnętrze na pojedyncze monomery, które mogą ponownie zostać użyte przez komórkę [Yang i Klionsky, 2009].

Do niedawna proces autofagii uważano za system przeznaczony do degradacji białek i małych organelli komórkowych [Yang i Klionsky, 2009]. Jednak doniesienia ostatnich lat przyniosły informacje, że proces ten może posłużyć także do degradacji cukrów, między innymi GAG [Moskot i wsp., 2014]. Idea ta jest o tyle nowa, że do tej pory nikt nie próbował wykorzystywać aktywacji autofagii jako terapii dla MPS. Autofagia indukowana przez różnego rodzaju związki naturalne jest rozpatrywana jako jedna z najbardziej obiecujących strategii terapeutycznych w wielu chorobach związanych z agregacją białek (choroba Huntingtona, Alzheimera i Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne, choroba prionowa) [Harris i Rubinsztein, 2011]. W przypadku MPS, oprócz genisteiny, nie znane jest działanie żadnych induktorów procesu autofagii w aspekcie degradacji GAG.

Wykonane przez autorów projektu badania wstępne in vitro prowadzone na fibroblastach pobranych od pacjentów z MPS III wykazały, że związkami charakteryzującymi się szczególną aktywnością w obniżaniu poziomu GAG poprzez indukcję procesu autofagii są kurkumina, kapsaicyna i resweratrol. Związki te indukują autofagię poprzez szlak JNK1/Beklina/PI3K i są niezwykle efektywne w przypadku usuwania agregatów białkowych w różnych chorobach neurodegeneracyjnych tj. choroba Huntingtona, Parkinsona czy Alzheimera [Pierzynowska i wsp., 2018]. Jednak nieznany pozostaje wpływ tych cząsteczek na:

1) behawior zwierząt stanowiących model MPS III tj. zachowania lękowe, pamięć, uczenie się, motoryka

2) poziom GAG w różnych tkankach i płynach ustrojowych organizmu

3) obwodowe i ośrodkowe procesy zapalne, których występowanie jest ściśle związane z rozwojem choroby.

2. Cel naukowy projektu

Cel ogólny:

Celem naukowym projektu jest określenie czy trzy badane związki – kurkumina, kapsaicyna i resweratrol – mogą być potencjalnymi lekami dla MPS IIIB.

Cele szczegółowe:

Określenie wpływu kurkuminy, kapsaicyny i resweratrolu na:

1) zachowania lękowe, motorykę, uczenie się i procesy pamięciowe u myszy z MPS IIIB;

2) poziom GAG w ośrodkowym układzie nerwowym, wątrobie, nerkach, moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym u myszy z MPS IIIB;

3) obwodowe i ośrodkowe markery stanu zapalnego u myszy z MPS IIIB;

4) stopień neurodegeneracji myszy z MPS IIIB.

3. Wyniki wstępne

W ramach badań wstępnych wykonano doświadczenia na modelu fibroblastów pobranych od pacjentów ze wszystkimi typami MPS III. Komórki te inkubowano w standardowych warunkach (pożywka DMEM suplementowana bydlęcą surowicą płodową oraz antybiotykami, 37oC, 5% wysycenia CO2, 95% wilgotności) we wzrastających stężeniach różnych induktorów autofagii tj. resweratrolu, kalcytriolu, kapsaicyny, kurkuminy, trehalozy.

Ogólny poziom GAG po inkubacji komórek z wymienionymi uprzednio związkami określany był przy pomocy zestawu Glycosaminoglycan Assay Blyscan, w którym wykorzystuje się błękit 1,9-dimetylometylenowy (DMMB). Barwnik ten wiąże się do siarczanowanych łańcuchów GAG, pozwalając na kolorymetryczne oznaczenie ich ilości w próbie. Natomiast poziom już samego siarczanu heparanu określany był przy pomocy techniki dot blot z użyciem specyficznych przeciwciał.

Wyniki tych badań wykazały, że najbardziej efektywne w obniżaniu poziomu GAG okazały się kurkumina, kapsaicyna i resweratrol, a obserwowany pod ich wpływem spadek poziomu GAG zawsze skorelowany był z indukcją procesu autofagii w tych komórkach. Ponadto, w przypadku resweratrolu zaobserwowano również pozytywny wpływ na hamowanie syntezy GAG co wskazują na plejotropowe działanie tego związku w obniżaniu poziomu GAG w komórkach. Komórki te charakteryzowały się niezmienioną żywotnością co potwierdza brak efektu cytotoksyczności testowanych związków.

Dlatego to właśnie te trzy związki, kurkumina, kapsaicyna i resweratrol, jako najbardziej obiecujące cząsteczki, przetestowane zostaną podczas realizacji tego projektu na mysim modelu MPS IIIB.

4. Plan pracy                                                                                 

4.1. Model do badań

Doświadczenia przeprowadzone zostaną na myszach MPS IIIB (B6.129S6-Naglutm1Efn/J). Zwierzęta zakupione zostaną z certyfikowanego laboratorium hodowlanego Jackson Laboratories (USA) (numer katalogowy myszy: 003827 | Naglu-).

Po urodzeniu myszy homozygotyczne mają normalny rozmiar i nie wykazują żadnych zaburzeń fizycznych ani behawioralnych w stosunku do myszy zdrowych. Brak enzymu lizosomalnego alfa-N-acetyloglukozaminidazy (Naglu) obserwuje się we wszystkich tkankach. Duże ilości siarczanu heparanu gromadzą się w wątrobie i nerkach, a mniejsze ilości w innych narządach. W wieku około miesiąca w większości tkanek obserwuje się aktywację makrofagów co jest oznaką stanu zapalnego (również w tkance nerwowej), a efekt ten pogłębia się wraz z upływem czasu. Po 4-5 miesiącach myszy wykazują nieprawidłowe zachowania motoryczne w teście otwartego pola. Przeżywalność myszy wynosi 8-12 miesięcy. Zwierzęta te są szeroko stosowanym modelem do badania patofizjologii MPS III B i do opracowywania nowych terapii.

4.2. Układ eksperymentalny i koncepcja badań

Myszy MPS IIIB utrzymane będą jako hodowla wsobna osobników heterozygotycznych przy stałych warunkach temperatury i wilgotności powietrza oraz cyklicznym oświetleniu dzień/noc – 12h/12h. Ściółkę stanowić będą wolne od zanieczyszczeń wiórki osikowe, a zwierzęta będą miały stały dostęp do wody i paszy.

Po upływie tygodnia od urodzenia, myszy będą genotypowane (płeć, NAGLU) i na tej podstawie po 2 tygodniach od urodzenia będą zakwalifikowane do różnych grup eksperymentalnych:

a) myszy zdrowe (NAGLU+/+ WODA), którym podawana będzie woda (grupa kontrolna pozytywna);

b) myszy zdrowe (NAGLU+/+ KAPSAICYNA), którym podawana będzie kapsaicyna;

c) myszy zdrowe (NAGLU+/+ KURKUMINA), którym podawana będzie kurkumina;

d) myszy zdrowe (NAGLU+/+ RESWERATROL), którym podawany będzie resweratrol;

e) myszy chore (NAGLU-/- WODA), którym podawana będzie woda (grupa kontrolna negatywna);

f) myszy chore ((NAGLU-/- KAPSAICYNA), którym podawana będzie kapsaicyna;

g) myszy chore (NAGLU-/- KURKUMINA), którym podawana będzie kurkumina;

h) myszy chore (NAGLU-/- RESWERATROL), którym podawany będzie resweratrol.

Liczebność każdej grupy zaplanowana jest na 8 osobników (samców lub samic). Aby oszacować liczbę zwierząt w grupach użyto programu „Power Analysis”. Obliczenia wskazały, że 8 myszy w każdej grupie stanowi absolutne minimum aby móc wykryć różnice między grupami na poziomie co najmniej 30%.

Zarówno testowane związki oraz woda podane zostaną zaraz po przystosowaniu układu pokarmowego do spożywania stałego pokarmu (zwykle jest to okres ~4 tygodni) co pozwoli na jak najkorzystniejsze określenie wpływu tych związków na rozwój objawów choroby.

Po upływie miesiąca od rozpoczęcia podawania związków myszy przejdą szereg testów behawioralnych po których cyklicznie pobierana będzie krew i mocz do badań. Zważając na szerokie spektrum objawów, zarówno lokomotorycznych, emocjonalnych jak i zaburzeń poznawczych, testy behawioralne obejmą: 1) ocenę zachowania myszy w nowym otoczeniu, 2) ocenę koordynacji ruchowej, 3) pomiar nasilenia lęku, 4) siłę uchwytu myszy, 5) pomiar zdolności do zapamiętywania, 6) określenie ogólnej aktywności motorycznej myszy. Testy te i pobór materiału powtarzany będzie co 1,5-2 miesiące. Dodatkowo cotygodniowo kontrolowana będzie masa ciała zwierząt.

Myszy poddane zostaną eutanazji w wieku 9 miesięcy (czas dobrany pod kątem minimalnej przewidywanej przeżywalności zwierząt z grupy kontrolnej negatywnej). W momencie eutanazji pobrane zostaną narządy takie jak nerki i wątroba oraz mózgowie, a także płyny ustrojowe takie jak mocz, krew i płyn mózgowo rdzeniowy.

Pobrane tkanki i narządy posłużą następnie do analiz molekularnych i biochemicznych na które będą składać się:

a) pomiar poziomu GAG w nerkach, wątrobie, mózgu, moczu, płynu mózgowo-rdzeniowym;

b) pomiar stężenia markerów stanu zapalnego w osoczu (CRP, IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α);

c) pomiar poziomu markerów procesu autofagii (LC3-II, LAMP2, liczba lizosomów);

d) ocena stopnia neurodegeneracji mózgowia.

5. Metodologia

5.1. Podawanie kurkuminy, kapsaicyny i resweratrolu

Myszom z grup badanych (nie kontrolnych) testowane związki podawana będą dożołądkowo przy pomocy zgłębnika żołądkowego. Odpowiednio grupy kontrolne otrzymają wodę w objętości równiej największej objętości jednego z testowanych związków. Czas podania opisano w rozdziale 4.

5.2. Testy behawioralne

Ogólna aktywność zwierząt i ich motoryka zbadana zostanie przy pomocy testu nowości, testu otwartego pola i testu zawieszenia na drążku, z kolei zaburzenia poznawcze ocenione zostaną przy pomocy labiryntu wodnego Morrisa. Co więcej, zaburzenia w zachowaniach emocjonalnych zwierząt (w tym zaburzenia lękowe) zmierzone będą testem uniesionego labiryntu krzyżowego.

5.3.  Testy molekularne i biochemiczne

5.3.1. Preparatyka

Po zakończeniu eksperymentu myszy poddane zostaną narkozie wziewnej przy pomocy izofluranu, a następnie dootrzewnowo otrzymają letalną dawkę narkozy pentobarbitalowej. Uzyskane w wyniku homogenizacji lub cięcia na skrawki tkanki posłużą do analiz molekularnych lub biochemicznych.

5.3.2. Analizy eksperymentale

Analiza poziomu białek takich jak LC3-II i LAMP wykonana zostanie technika Western-blotting. Analiza ogólnego poziomu GAG w różnych tkankach przy pomocy zestawu Glycosaminoglycan Assay Blyscan, natomiast samego siarczanu heparanu – przy pomocy techniki ELISA, podobnie jak wszystkie markery stanu zapalnego (z osocza). Stopień neurodegeneracji oraz liczba lizosomów zbadana zostanie przy pomocy odpowiednio, barwnika FluoroJade oraz barwnika LysoTracker na skrawkach mózgowia.

Wszyscy wykonawcy projektu dysponują doświadczeniem w wykorzystywaniu technik z zakresu biologii molekularnej (Western blotting, immunofluorescencja, analizy poziomów GAG, ELISA) oraz badań behawioralnych zwierząt. Wszystkie wyniki poddane zostaną analizie statystycznej z wykorzystaniem programu Statistica. Wykonawcy projektu posiadają ukończone szkolenie dla osób: odpowiedzialnych za planowanie procedur i doświadczeń oraz za ich przeprowadzanie, wykonujących procedury, uczestniczących w wykonywaniu procedur i uśmiercających zwierzęta wykorzystywane w procedurach zrealizowane zgodnie z programem określonym w załącznikach nr 1, 2, 3 i 4 do Rozporządzenia Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego z dnia 5 maja 2015 r. w sprawie szkoleń, praktyk i staży dla osób wykonujących czynności związane z wykorzystywaniem zwierząt do celów naukowych lub edukacyjnych (Dz.U. poz. 628 z dnia 08.05.2015). Badania te przeprowadzone zostaną za zgodą komisji etycznej ds. badań nad zwierzętami.

ZESPÓŁ REALIZUJĄCY PROJEKT:

Prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn

Dr Magdalena Podlacha

Mgr Karolina Pierzynowska

Mgr Lidia Gaffke