CoQ10 W CHOROBIE SANFILIPPO

Projekt: „CoQ10 w chorobie Sanfilippo”, Profesor Grzegorz Węgrzyn, Uniwersytet Gdański, Polska

Raport

Wstęp

Badania Matalongi i wsp. [Matalonga, L. et al. (2014) Treatment effect of coenzyme Q(10) and an antioxidant cocktail in fibroblasts of patients with Sanfilippo disease. J. Inherit. Metab. Dis. 37, 439–446] przeprowadzone na fibroblastach pochodzących od pacjentów cierpiących na MPS IIIA i IIIB wykazały, że inkubacja komórek w obecności CoQ10 skutkuje obniżeniem poziomu glikozoaminoglikanów (GAG), jednak tylko w dwóch liniach podtypu MPS IIIB i jednej linii MPS IIIA (na 5 testowanych linii; w dwóch pozostałych liniach komórkowych nie zaobserwowano żadnych zmian). Równocześnie zaobserwowano podwyższenie aktywności deficytowego enzymu, ale dotyczyło to wyłącznie linii podtypu MPS IIIB. Nie wyjaśniona jest przyczyna otrzymania tak zróżnicowanych wyników. Nie wiadomo również czy analogiczna zależność występuje w pozostałych podtypach MPS III oraz czy CoQ10 mógłby zwiększać aktywność pozostałych enzymów (w innych podtypach MPS III).

Cel/hipotezy badań

Celem niniejszego projektu jest kompleksowe określenie wpływu CoQ10 na poziom GAG we wszystkich podtypach mukopolisacharydozy typu III (choroby Sanfilippo), gdyż dotychczasowe dane literaturowe na ten temat są fragmentaryczne, niejednoznaczne oraz dotyczą tylko dwóch wybranych podtypów opisywanej choroby.

W pierwszym etapie badań zostanie określony poziom GAG w komórkach inkubowanych w obecności wzrastających stężeń CoQ10 oraz wpływ tego związku na aktywność enzymów, których niedobór obserwuje się w MPS. Będą to kolejno: MPSIIIA – N-sulfataza siarczanu heparanu, MPSIIIB – alfa-N-acetyloglukozoaminindaza, MPSIIIC – acetylotransferaza acetylo-CoA, MPSIIID – sulfataza-6-S-N-acetyloglukozoaminidu. Następnie, mając na uwadze badania wykazujące podwyższone parametry stresu genotoksycznego w różnych typach MPS oraz wiedzę na temat antyoksydacyjnych właściwości CoQ10 sprawdzony zostanie jego wpływ na poziom reaktywnych form tlenu (ROS). Ponadto, aby wykluczyć ewentualne cytotoksyczne działanie CoQ10 przeprowadzone zostaną testy żywotności komórek.

W drugim etapie zostaną przeprowadzone doświadczenia, w których do hodowli komórek MPS będą dodawane efektywne stężenia CoQ10 (określone w etapie 1) w połączeniu ze związkiem aktualnie testowanym w ramach próby klinicznej III fazy jako potencjalny lek na MPS III – genisteiny. Genisteina z jednej strony obniża efektywność syntezy GAG przez hamowanie szlaku przekazywania wewnątrzkomórkowych sygnałów z receptora EGFR, a z drugiej stymuluje biogenezę lizosomów, co powoduje zwiększenie efektywności degradacji obecnych w komórce GAG. Do tego etapu zostaną wybrane te podtypy MPS III, w których CoQ10 okazał się efektywny (obniżył ilość GAG lub zwiększył aktywność deficytowego enzymu). Połączenie takie może prowadzić w przyszłości do stworzenia ewentualnej terapii kombinowanej (łączonej) genisteiny z CoQ10, która to terapia może okazać się bardziej efektywna niż użycie każdego ze związków osobno.

Metody

Badania zostaną przeprowadzone przy użyciu fibroblastów pochodzących od pacjentów cierpiących na różne podtypy MPS III oraz komórkach zdrowych (HDFa). Linie komórkowe hodowane będą w standardowych warunkach, w pożywce DMEM suplementowanej surowicą bydlęcą oraz antybiotykami, w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO₂.

Analiza ilościowa GAG po inkubacji w obecności CoQ10 lub CoQ10 i genisteiny zostanie przeprowadzona za pomocą specyficznego barwienia z zastosowaniem zestawu Glycosaminoglycan Assay Blyscan oraz z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych testów ELISA. Poziom aktywności hydrolaz lizosomalnych zostanie określony przy użyciu enzymatycznych testów fluorymetrycznych. Poziom reaktywnych form tlenu zostanie zbadany za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu, a pomiar przeżywalności komórek przeprowadzony zostanie przy pomocy testu MTT.

Znaczenie projektu

Realizacja niniejszych badań przede wszystkim pomoże odpowiedzieć na pytanie czy koenzym Q10 może być w przyszłości stosowany jako uzupełnienie terapii mukopolisacharydozy typu III. W tym projekcie po raz pierwszy zostanie zbadany kompleksowy wpływ CoQ10 na wszystkie podtypy MPS III. Przeprowadzone badania pozwolą uzupełnić fragmentaryczną wiedzę na temat funkcjonowania lizosomów w chorobie Sanfilippo. Będzie to podstawą do przyszłych badań zmierzających do opracowania skutecznych terapii łączonych, które mogą niwelować większy zakres objawów choroby.

Zespół badawczy:

Prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn, mgr Joanna Brokowska, mgr Karolina Pierzynowska